載體指南
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哺乳動(dòng)物增強(qiáng)子檢測(cè)piggyBac載體(體內(nèi))
該載體系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于在小鼠模型中,高效分析哺乳動(dòng)物增強(qiáng)子。通常情況下,將感興趣的增強(qiáng)子克隆到該載體小鼠最小啟動(dòng)子Hsp68的上游,并將構(gòu)建好的載體用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠。對(duì)轉(zhuǎn)基因胚胎或成年小鼠中LacZ報(bào)告基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),可以進(jìn)一步分析增強(qiáng)子的活性。
PiggyBac載體系統(tǒng)可以非常高效地把外源DNA插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組,該系統(tǒng)技術(shù)簡(jiǎn)單,可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo))把您所感興趣的基因長(zhǎng)期穩(wěn)定地整合到靶細(xì)胞基因組。
PiggyBac系統(tǒng)包含兩個(gè)載體,一個(gè)載體被稱為輔助質(zhì)粒,負(fù)責(zé)編碼轉(zhuǎn)座酶;另一個(gè)載體被稱為轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒,包含兩個(gè)末端重復(fù)序列(TRs)以及兩者之間的被轉(zhuǎn)座區(qū)域,需要被轉(zhuǎn)座到宿主基因組中的目的基因就克隆在這個(gè)區(qū)域。當(dāng)輔助質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞時(shí),輔助質(zhì)粒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶將會(huì)識(shí)別轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)TR元件,然后將被轉(zhuǎn)座區(qū)和兩個(gè)TR元件插入到宿主基因組中。轉(zhuǎn)座插入通常發(fā)生在包含TTAA序列的宿主染色體位點(diǎn),并在轉(zhuǎn)座子兩側(cè)出現(xiàn)TTAA重復(fù)序列。
PiggyBac屬于II類轉(zhuǎn)座子,通過(guò)“剪切—粘貼”的機(jī)制移動(dòng),從一個(gè)地方轉(zhuǎn)座到另一個(gè)地方,而不留下序列本身(恰好相反,I類轉(zhuǎn)座子是通過(guò)“復(fù)制—粘貼”的方式移動(dòng))。由于輔助質(zhì)粒是通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞的,故會(huì)逐漸丟失。隨著輔助質(zhì)粒的丟失,轉(zhuǎn)座子在宿主基因組中變成了永久整合。當(dāng)這些宿主細(xì)胞再次被輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,整合的轉(zhuǎn)座子會(huì)再次通過(guò)“剪切—粘貼”的機(jī)制移動(dòng)。
關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息,請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。
參考文獻(xiàn) | 主題 |
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Nature. 444:499 (2006) | Genome-wide testing of putative enhancers in the mouse using a related system |
Development. 105:707 (1989) | Cloning of the Hsp68 minimal promoter |
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011) | Review of the piggyBac systems |
我們的載體系統(tǒng)是基于piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)而構(gòu)建的。待測(cè)增強(qiáng)子位于小鼠Hsp68最小啟動(dòng)子(Hsp68_mini)的上游,可控制下游LacZ報(bào)道基因的表達(dá)。有活性的增強(qiáng)子會(huì)促進(jìn)最小啟動(dòng)子增強(qiáng)LacZ基因的表達(dá);在缺乏活性增強(qiáng)子的情況下,Hsp68_mini具有非常弱的本底表達(dá)能力,會(huì)使LacZ基因弱表達(dá)或不表達(dá)。在胚胎或組織切片中,通過(guò)X-gal與LacZ的顯色作用可以高度靈敏地原位檢測(cè)增強(qiáng)子活性。
簡(jiǎn)單且靈敏:使用LacZ作為報(bào)告基因,X-gal染色會(huì)產(chǎn)生明顯的藍(lán)色,即使在低表達(dá)水平下也可以輕松檢測(cè)到,因此可以非常靈敏地判斷增強(qiáng)子活性。
易于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物:通過(guò)常規(guī)原核注射,可以很容易地高效制備轉(zhuǎn)基因胚胎或活體小鼠。
技術(shù)簡(jiǎn)單:通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞,相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝,過(guò)程更簡(jiǎn)單。
外源基因的永久整合:常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染只能實(shí)現(xiàn)外源基因的瞬時(shí)表達(dá),這種外源基因會(huì)隨著宿主細(xì)胞的分裂而不斷丟失,在快速分裂的細(xì)胞中顯得尤為顯著。相反,將PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體和輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,由于轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的作用下,目的基因能穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的染色體中,從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子載體上攜帶的目的基因在宿主細(xì)胞中永久表達(dá)。
載體容量大:我們的轉(zhuǎn)座子載體總?cè)萘靠蛇_(dá)30 kb,其中質(zhì)粒骨架只占3 kb,有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。
需要輔助質(zhì)粒:與常規(guī)質(zhì)粒LacZ報(bào)告基因載體不同,piggyBac載體系統(tǒng)需要使用兩種質(zhì)粒,分別是輔助質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒。為了有效地將增強(qiáng)子序列插入宿主基因組中,兩種質(zhì)粒必須存在于相同的細(xì)胞中。
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transposase can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.
Enhancer: Your enhancer of interest is cloned here.
Hsp68: The minimal promoter sequence from mouse Hsp68 (heat shock protein 68 kDa). This will drive transcription of the reporter if an enhancer element is present to activate it. In the absence of such enhancer activity, the minimal promoter only has basal activity.
LacZ: The beta-galactosidase reporter gene. The encoded enzyme converts the colorless and soluble X-gal to an intensely blue insoluble product that stains the cells in which LacZ is expressed.
SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
3' ITR: 3' inverted terminal repeat.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.